亚甲基蓝对于水生动物具有一定毒性，其毒性因不同水生动物而异。当使用浓度增加至一定程度时，会引起水生动物大量死亡，因此在使用时需要控制好浓度，确保其在安全范围内。研究表明，亚甲基蓝对糠虾幼体的安全浓度为0.029mg/L，对南美白对虾幼体的安全浓度为0.025mg/L，对高体鰟鲏等鱼类的安全浓度为0.96mg/L，对水丝蚓的安全浓度为2.64mg/L。
在亚甲基蓝药浴过程中，需采取遮光措施。药浴后，水体颜色会变蓝且持续时间较长，只能通过频繁换水来稀释颜色。此外，亚甲基蓝易与活性炭、沸点石等吸附性滤材结合，因此不宜在原缸中使用。当水温较低或水体有机质含量较高时，疗效较差。
使用10mg/L亚甲基蓝水溶液浸洗10-20分钟，可有效预防水霉病。